一、酸雜交技術(shù)：
　　檢驗(yàn)方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復(fù)雜的物體中，使無法感覺的特定物質(zhì)進(jìn)入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測技術(shù)就是利用核酸堿基嚴(yán)格配對的特異性，核酸標(biāo)記物的靈敏度而建立的檢測核酸結(jié)構(gòu)與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實(shí)驗(yàn)室用得多，臨床實(shí)驗(yàn)室用得較少，除成本高外，關(guān)鍵是操作復(fù)雜，重復(fù)性差，僅能半定量。成本高可隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展而緩和，但其它缺點(diǎn)尚需努力克服。
　　雜交實(shí)驗(yàn)的探針應(yīng)具有特異性，對應(yīng)不同的雜交方法靶基因（被檢基因）應(yīng)有一定的純度與豐度。雜交反應(yīng)的開始是碰撞，探針濃度高則速率增加，一般32P標(biāo)記探記探針5-100ng/ml，非放射性探針25-1000ng/ml，原位雜交無論放射還是非放射物標(biāo)記，一般都需0.1-5.0μg/ml。當(dāng)探針過量時(shí)，雜交速率取決于探針長度，如一個(gè)100ng/ml20個(gè)核苷酸的合成寡核苷酸探針與1-100pg 1kb長的靶基因雜交，10分鐘能達(dá)到最大雜交率。而相同條件下2kb的克隆探針需160小時(shí)。主要原因是這里所指濃度是重量濃度而非摩爾濃度。長探針因標(biāo)記量大，小的摩爾濃度已足以達(dá)到需要的檢測靈敏度。為了促進(jìn)長探針（＞250個(gè)核苷酸）的雜交速率，加入雜交促進(jìn)劑是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用濃度為5％-10％，濃度過高會(huì)增加雜交液粘度。聚乙二醇也作為促進(jìn)劑，價(jià)廉且粘度低，但檢測本底太高。另外雜交的溫度、鹽濃度、甲酰胺濃度可調(diào)節(jié)雜交分子形成的穩(wěn)定性。理論選用DNA：DNA雜交溫度T＝Tm－25℃，此時(shí)雜交分子最易形成。但具體實(shí)驗(yàn)中影響Tm值的因素很多，一般雜交溫度低，形成的雜交分子較穩(wěn)定。RNA：DNA雜交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA雜交分子的Tm大20-25℃，使得雜交溫度提高，此時(shí)需調(diào)節(jié)甲酰胺濃度來調(diào)節(jié)雜交溫度。好的實(shí)驗(yàn)條件最終應(yīng)在實(shí)踐中摸索建立。

　　（一）點(diǎn)雜交：
　　用探針進(jìn)行雜交。尼龍膜，特別是聚偏氟乙烯膜（PVDF）與DNA結(jié)合力更高，堅(jiān)韌、易操作。點(diǎn)樣可手工，也可用真空點(diǎn)樣品。檢測可用放射性探針自顯影或非放射性探針顯色�？捎糜�DNA或RNA分析。下面以非放射性探針分析DNA為例，結(jié)果是顯色。
　　取硝酸纖維素膜和濾紙?jiān)?FONT face=Calibri>2xSSC（NaCl 300mmol/L，檸檬酸鈉30mmol/L），pH7.0浸15分鐘，平鋪濾紙?jiān)邳c(diǎn)樣抽濾器上，再鋪上硝酸纖維濾膜，真空抽氣使點(diǎn)樣器減壓，膜顯出凹面。點(diǎn)樣50μl（5-10μgDNA，可直接點(diǎn)血清樣品）于凹面，撤去真空，把膜晾干。取濾紙浸0.5mol/L NaOH，1.0mol/L NaCl，把膜平鋪于濾紙上20分鐘，變性。取濾紙二張分別浸在0.5mol/L Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/L Tris-HCl，0.6mol/L NaCl pH7.5，分別依次把膜平鋪于濾紙上，各中和15分鐘，中和后膜的pH為7.2-7.5。于80℃，30-45分鐘烘干。（RNA分析點(diǎn)樣緩沖液系統(tǒng)不同，無需變性，中和，余大致相同）用塑料封口機(jī)把膜和2.5ml預(yù)雜交緩沖液封入塑料袋中，42℃，水浴30分鐘。
　　探針2ml（50-100ng/2ml預(yù)雜交緩沖液）于100℃，10分鐘，馬上置冰浴5分鐘（變性）。加入袋封口。42℃水浴過夜。去雜交液（可回收）。以2xSSC，0.1％SDS15ml，50℃5分鐘洗二次。0.1SSC，0.1％SDS洗二次。封閉：另取袋封入膜和封閉液（蛋白質(zhì)50mg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5）/150mmol/L NaCl）2.5ml，37℃，30分鐘。去封閉液（可回收）。100mmol/L Tris-HCl（pH7.5）/150mmol/L NaCl ，15ml，5分鐘洗二次。親和反應(yīng)：酶標(biāo)抗體3ml（酶有堿性磷酸酶、過氧化物酶等，標(biāo)記物有抗地高辛、生物素等，現(xiàn)以地高辛標(biāo)堿性磷酸酶為例4μg/3ml 100mmol/L Tris-HCl，150mmol/L MgCl2，10mg/ml牛血清白蛋白），封入袋中37℃，30分鐘。100mmol/L Tris-Hcl，100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl2，pH9.5，10ml，1分鐘洗一次。取硝基四氮唑蘭（NBT）75mg/ml 70％二甲基甲酰胺25μl，4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl（底物）和100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl2，pH9.5 6ml混勻，37℃，避光反應(yīng)三小時(shí)，顯色。蒸餾水洗膜，晾干。觀察結(jié)果。

　　（二）Southern blot
　　1975年E.Southern發(fā)明了將DNA切開，電泳分離，再變性，印跡到硝酸纖維（Nc）濾膜上，用探針進(jìn)行雜交，檢測DNA的方法。自顯影或顯色用于DNA分析。以32P標(biāo)記放射性探針為例，放射自顯影觀察結(jié)果。
　　前述分離、純化的DNA樣品5-10μg/100μl TE，加限制性內(nèi)切酶3Unit/1μgDNA和內(nèi)切酶相應(yīng)緩沖液，在相應(yīng)溫度保溫1-3小時(shí)（不同的酶所用的緩沖液和溫度不同），乙醇沉淀，15-20μl TE溶解DNA斷片。前述電泳條件，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Marker，Ladder）一起，3-4V/cm電泳（30V12-15小時(shí)）。在紫外光下觀察Marker充分分離，結(jié)束電泳。將膠放入0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液體中30分鐘，使DNA變性。同時(shí)將膜用蒸餾水浸潤，在0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液體的方盤皿上，放上濾紙兩頭浸在液體中，依次放上凝膠、膜、濾紙、一尺厚的吸水紙，壓力1kg的重物。轉(zhuǎn)移（印跡，blot）過夜。翌日，把膜放在0.5mol/L Tris-HCl，pH7.0-7.5，1mol/L NaCl液中，中和膜上堿性變性液15-30分鐘。戴上手套，用手指壓在膜上來回充分洗膜。室溫干燥一小時(shí)。用塑料封口機(jī)，把膜和預(yù)雜交緩沖液封在塑料口袋中，注意驅(qū)除袋內(nèi)汽泡。熱水浴過夜。探針變性后，加入袋中再封口。熱水浴過夜。

　　（三）Northern blot
　　用于RNA分析，電泳條件與轉(zhuǎn)膜方法與Southern blot不同外，RNA不必變性與中和，電泳時(shí)加電醛防止RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成。其它步驟相同。為了防止RNase水解需分析的mRNA，盡可能將器皿在160-180℃干熱滅菌8小時(shí)以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）泡2小時(shí)，滅菌水淋洗干凈，100℃干烤15分鐘。不能干熱滅菌的試劑等，也可加1％DEPC處理12小時(shí)（但不能用于Tris）后，100℃。加熱15分鐘（或高壓滅菌15分鐘）以抑制、分解RNase。1.0g瓊脂糖，滅菌水80ml加熱溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，滅菌水至1000ml。樣品緩沖液，x50TAE20μl，50％去離子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混勻。約10-30μg/10μl純化的RNA樣品，加二倍（20μl）樣品緩沖液（可點(diǎn)樣一個(gè)凝膠孔lane）。60℃水浴15min，馬上置冰浴。加1/10電泳指示劑。點(diǎn)樣電泳，75-80V電泳4-5小時(shí)（指示劑泳動(dòng)7～8cm），結(jié)束電泳。電泳期間正負(fù)極緩沖液要不斷交換（可用蠕動(dòng)泵），以免pH改變。電泳結(jié)束，將凝膠放在紫外光下可觀察到人rRNA大亞基28S（5.1kb），小亞基18S（2.0kb），記下大小亞基移動(dòng)距離（或拍照），可作為被測mRNA分子量分析的參照物。凝膠在50mmol/L NaOH中變性30分鐘（低濃度堿，此步可�。�。膜在10xSSPE中浸20分鐘。用10xSSPE轉(zhuǎn)移過夜（同Southern blot）。80℃1-2小時(shí)干燥。用探針雜交后，顯影或顯色。

　　（四）原位雜交（insitu hybridization）
　　在保持細(xì)胞形狀條件下，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)雜交，顯影或顯色。用于DNA或RNA分析。細(xì)胞用離心涂片機(jī)涂片或組織切片置于載玻片上。4％多聚甲醛（PFA）/PBS固定（固定時(shí)間因標(biāo)本而異10-20分鐘，也可用含2％甲醛，0.05％戊二醛，2.5mmol/L CaCl2的0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.3，500W微波爐中照射10-20秒，固定）。馬上用PBS洗標(biāo)本三次，2.5μg/ml蛋白酶K，37℃，5-20分鐘（因標(biāo)本和固定條件而定）處理。磷酸鹽類緩沖液（PBS NaCl 137mmol/l，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO48.1mmol/L，KH2PO41.5mmol/L）洗滌。4％PFA/PBS后固定，PBS洗一次，0.2％甘氨酸/PBS洗二次，每次15分鐘。預(yù)雜交：42℃，1小時(shí)。預(yù)雜交緩沖液：10％硫酸葡聚糖，10％Denhardt液，0.5％吐溫－20，250μg/ml鮭魚精子DNA，500μg/ml酵母tRNA。雜交：42℃，4小時(shí)。用2x雜交緩沖液（4xSSC，0.2mol/L磷酸鈉pH6.5，2xDenhardt）溶解已標(biāo)記探針，使其終濃度為0.1-1.0μg/ml。DNA檢測時(shí)把探針覆蓋在標(biāo)本上，置100℃5分鐘（變性）取出，雜交。mRNA檢測則先把探針置95℃水浴3分鐘，立即置冰水浴，再覆蓋標(biāo)本上進(jìn)行雜交。覆蓋標(biāo)本用液量100-200μl洗滌：2xSSC，50℃過夜。0.2xSSC，室溫1小時(shí)。載玻片浸在緩沖液中。顯色（試劑、方法參照斑點(diǎn)雜交的封閉-顯色部分）20分鐘-2小時(shí)，顯微鏡下觀察結(jié)果。

　　二、增技術(shù)
　　通過大腸埃希菌繁殖而增殖重組質(zhì)粒，也是擴(kuò)增核酸的手段。但在試管中有效擴(kuò)增DNA的方法，是在90年代才開展起來的多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）新技術(shù)。由于PCR靈敏度高、特異性好、操作方便，在我國發(fā)展很快。目前，PCR技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)雜交技術(shù)等）開發(fā)了許多PCR新技術(shù)（reverse transcriptase PCR；PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR（二次PCR）；熱啟動(dòng)PCR等）。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于點(diǎn)突變分析；二次PCR特異性好，靈敏度高；熱啟動(dòng)PCR可提高特異性。 PCR技術(shù)原理是在了解DNA一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物（primer或sense，人工合成），DNA多聚酶可識(shí)別并結(jié)合引物，以單鏈DNA為模板，dNTP為底物，合成其互補(bǔ)鏈。通過反復(fù)變性，反復(fù)合成互補(bǔ)鏈的過程，達(dá)到DNA擴(kuò)增的目的。人的DNA擴(kuò)增引物長度多為20個(gè)核甘酸。
　　將反應(yīng)物和Marker點(diǎn)樣于凝膠一起電泳，紫外光下觀察結(jié)果，拍照保存結(jié)果。反應(yīng)物也可用于印跡（雜交）實(shí)驗(yàn)、多態(tài)分析、探針制備等。
　　注意事項(xiàng)：①DNA樣品純度高，Taq酶（和Klenow酶）有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②設(shè)計(jì)的引物分子內(nèi)（特別3′端）和引物，1，2分子間不形成雙鏈。選擇性好，不增幅目的DNA以外區(qū)域的DNA。引物的G＋C含量為40％-60％。③dNTP濃度過高易使Taq酶合成錯(cuò)誤，一般在200μmol/L，有人建議40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L對酶有抑制作用。Mg2+濃度過高，NDA不易變性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶從嗜熱菌分離得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐熱每經(jīng)過一次熱變性要補(bǔ)加一次酶），現(xiàn)在經(jīng)基因克隆的重組體產(chǎn)物Taq酶最適pH8.3～8.8（室溫8.3-8.4），反應(yīng)溫度75-80℃，95℃以上失活明顯。無3′→5′校讀活性，對SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐溫－20可抵制SDS抑制＝。該酶有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。⑥退火溫度一般設(shè)定為Tm－5℃，但實(shí)際上與引物一級結(jié)構(gòu)序列有關(guān)，設(shè)計(jì)不當(dāng)可造成非特異性退火，而造成非特異擴(kuò)增，此時(shí)應(yīng)調(diào)整溫度和相應(yīng)的時(shí)間。⑦循環(huán)次數(shù)受到的影響因素較多，增加次數(shù)可提高靈敏度，但易出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。⑧PCR靈敏高，被檢樣品極易被污染，樣品純化，擴(kuò)增，檢測區(qū)域應(yīng)分開。房間應(yīng)經(jīng)常用紫外光照射。擴(kuò)增物應(yīng)定點(diǎn)丟棄，處理。

　　三、核酸限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析
　　RFLP分析是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡（blot）技術(shù)、探針-雜交技術(shù)的綜合應(yīng)用，多用于臨床遺傳性疾病的基因診斷。基本原理是遺傳性疾病多有基因的缺陷，如基因缺失、基因插入、編碼區(qū)小范圍核苷酸序列改變或點(diǎn)突變等。前二者可將純化的正常人和病人DNA同時(shí)用限制性內(nèi)切酶切成片段，經(jīng)電泳分離、印跡、探針雜交等找到目的基因。由于患者基因的缺失或插入，造成被限制性內(nèi)切酶切開的片段（分子量）大小與正常人發(fā)生差異（限制性片段長度多態(tài)），使其電泳遷移率發(fā)生差異，而達(dá)到基因診斷的目的。小區(qū)域或點(diǎn)突變，可選用一個(gè)限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)正好在這一變異位置，使切割作用和正常人發(fā)生差異（如正常人基因可切斷而患者不能，或反之），達(dá)到診斷目的�，F(xiàn)在PCR產(chǎn)物經(jīng)變性為DNA單鏈，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，只要有一個(gè)核苷酸發(fā)生變異，其電泳遷移率就會(huì)改變，進(jìn)行多態(tài)分析（PCR-SSCP）。實(shí)際上把基因的異常位置設(shè)計(jì)在PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，就能進(jìn)行多態(tài)分析。
　　核酸純化→內(nèi)切酶作用→電泳分離→Southern blot→探針-雜交→顯影，顯色。

　　四、核酸一級結(jié)構(gòu)（核苷酸序列sequence）分析
　　核酸一級結(jié)構(gòu)分析是基因分析最直接的第一手資料。目前DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析中，DNA的堿基序列分析方法多樣、簡單、快速。下面就M13噬菌體-雙脫氧核苷酸（ddNTP）的DNA測序法介紹如下。 M13是單鏈DNA噬菌體，轉(zhuǎn)染宿主菌體復(fù)制為雙鏈增殖，又以單鏈形式透出菌體。把待測DNA重組插入雙鏈M13復(fù)制型DNA中，經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增，可分離得到單鏈M13DNA（含待測單鏈DNA的堿基序列），即復(fù)制模板。在待測DNA的3′端人工合成引物，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，復(fù)制鏈延長。在ddNTP（2′,3′雙脫氧核糖核苷三磷酸）存在下，復(fù)制延長隨機(jī)受阻，形成分子量（長度）大小不等的片段。電泳分離，自顯影，分析堿基序列。
　　核酸堿基序列分析：0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝膠，高壓（1600V）電泳，可分辨一個(gè)核苷酸的差異。電泳后干燥凝膠，自顯影，自下往上讀圖，得到5′→3′的合成鏈堿基序列，其互補(bǔ)鏈?zhǔn)谴郎yDNA的3′→5′堿基序列。