如何提取總RNA，完整RNA的提取和純化，是進(jìn)行RNA方面的研究工作，如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即１）：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；２），有效地使核蛋白復(fù)合體變性；３），對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；４）：有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；5）：對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑，1），提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；2），直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。

如何提取總RNA，方法一：總RNA的試劑盒快速提取。
一些公司推出的總RNA提取試劑盒，可以用來制備高質(zhì)量的可用于建庫的RNA。該總RNA純化系統(tǒng)采用兩種著名的RNA酶抑制劑，異硫氰酸弧（GTC）和β-巰基乙醇，加上整個操作都在冰浴下進(jìn)行，這樣就能顯著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA，則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進(jìn)入水相，這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，而RNA中如含無機(jī)鹽，則有可能對以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。

一：儀器：恒溫水浴，冷凍高速離心機(jī)，紫外分光光度計，取液器，電泳儀，電泳槽。

二：試劑：RNA提取試劑盒，0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC），75%乙醇

三：操作步驟
（一）：細(xì)胞或組織破碎
A：微生物材料
１：發(fā)酵3~4天（或?qū)��?shù)生長期）的菌體，離心收集菌絲體（動植物材料無需此步處理）。
２：用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體2~3次，并盡量除去殘存的水。
３：加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。
４：研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至１２ml變性液的容器中勻漿。

B：動植物細(xì)胞培養(yǎng)材料（適用的樣品量為細(xì)胞：108）。
1：細(xì)胞或組織培養(yǎng)：按常規(guī)方法進(jìn)行。
2：深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎：
（1）細(xì)胞收集：含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中，4℃，3000g離心5分鐘。
（2）細(xì)胞洗滌：上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3000g離心5分鐘。
（3）細(xì)胞破碎：在沉淀細(xì)胞中加入15毫升預(yù)冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿。
3：表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎：
（1）確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108。
（2）細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒掉，用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中加入8毫升預(yù)冷變性液，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞溶解，此時可見粘度加大。
（3）用無菌吸管將第一個培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細(xì)胞，再吸入第三個培養(yǎng)瓶，以此類推，直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從第一個培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。
（4）將上述12毫升含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50毫升無菌離心管中，勻漿破碎細(xì)胞。

C：植物組織破碎（適用的樣品量為0.05g組織）。
（1）將600ul變性液置于1.5ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）將0.05g新鮮組織用液氮冰凍。
（3）在液氮下，研磨組織塊。
（4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。

D：動物組織破碎（適用的樣品量為1克組織）
（1）將12毫升變性液置于50毫升離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）在上述管中加入1克新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎。

注1：研磨組織塊用于RNA提取的樣品，必須是新鮮的細(xì)胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。
2：變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷。

（二）：RNA的抽提：
在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。
600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10000g，20分鐘。
上層水相吸至無菌離心管中+等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。
離心4℃，10000g，20分鐘。
沉淀RNA，冷凍干燥15分鐘，RNA沉淀重新溶于300ul變性液中，可振蕩（有時為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時間應(yīng)極短）。
60ulpH4.0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。
600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
冰浴中10~15分鐘，離心，4℃，10000g，20分鐘。
上層水相吸至無菌離心管中。
等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），75％乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥，復(fù)溶于去RNA酶的水中（對于準(zhǔn)備長期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25M，再加入2.5體積的乙醇，~70℃保存。）

注：1變性液組成：25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB（42mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2mM β-巰基乙醇），65℃溶解，過濾滅菌，4℃預(yù)冷。
2酸性酚配制：55℃時，500g酚溶入500ml50mM，pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復(fù)加500ml50mM，pH4.0乙酸鈉，直到pH<4.1。