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菌種保存和微生物常識(shí)

[2014/11/17]

  菌種保存和微生物常識(shí)

  1、常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒

  營(yíng)養(yǎng):從外部環(huán)境攝取其生命活動(dòng)所必需的能量和物質(zhì),滿足生長(zhǎng)和繁殖需要的一種生理過(guò)程。是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),是生命活動(dòng)的起點(diǎn)。

  營(yíng)養(yǎng)物:具有營(yíng)養(yǎng)功能的物質(zhì)。也包括光能。提供生物的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和良好的生理環(huán)境。

  營(yíng)養(yǎng)要素:碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和水

  培養(yǎng)基:人工配制、適合微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。要求:應(yīng)具備6大營(yíng)養(yǎng)要素;物質(zhì)比例合適;必須滅菌。

  2、選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的原則、方法及制備過(guò)程

  原則:目的明確 、營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)、經(jīng)濟(jì)節(jié)約

  物理化學(xué)條件適宜

  方法:生態(tài)模擬、查閱文獻(xiàn)

  精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較

  步驟:稱量、熔化、調(diào)PH、過(guò)濾、分裝、

  加塞、包扎、滅菌、冷卻、無(wú)菌檢查

  培養(yǎng)基種類:

  一、按成分的不同分

  天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基

  二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分

  固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基

  三、按培養(yǎng)基用途

  基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 、加富培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基

  消毒與滅菌 :

  消毒:消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體

  滅菌:殺滅一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體,芽胞和孢子。

  方法:

  一、物理的方法:加熱、過(guò)濾、輻射

  二、化學(xué)的方法:用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。如重金屬離子,磺胺類藥物及抗生素等。

  加熱法:

  (1)干熱法:火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。

  1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等,試管口和瓶口,涂布用玻璃棒。

  2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣(160-170C)加熱滅菌1-2h,適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性,與水的含量有關(guān),當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大,凝固越快。

  3、注意事項(xiàng):

  1)培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法;

  2)溫度控制在<180°;

  3)物品不能太擠;

  4)溫度降至70°時(shí)才開(kāi)箱門。

  (2)濕熱法 :原理:因?yàn)闈駸嶂芯w吸水,蛋白質(zhì)容易凝固,因蛋白質(zhì)含水量增加,所需凝固溫度降低;濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。

  高壓蒸汽滅菌法:

  1、設(shè)備:高壓滅菌鍋

  2、時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。

  3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌,也可用于玻璃器皿的滅菌。

  4、注意事項(xiàng):

  1)冷空氣徹底排除;2)加水;3)壓力降為“0”時(shí)方可打開(kāi)。

  常壓蒸汽滅菌:對(duì)于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基,含糖培養(yǎng)基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。

  煮沸滅菌法:適用注射器和解剖器皿,時(shí)間10-15min,

  超高溫殺菌:135-150°C和2-8s對(duì)牛乳和其它液態(tài)食品。優(yōu)點(diǎn) :保持食品價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)成分。

  過(guò)濾除菌:

  原理:介質(zhì)在有壓力時(shí)阻隔微生物。

  適用范圍:許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。

  設(shè)備:蔡氏過(guò)濾器,濾膜過(guò)濾器。

  優(yōu)缺點(diǎn):不破壞培養(yǎng)基成分,只適用少量濾液。需 大量無(wú)菌空氣以及凈化工作臺(tái)。

  注意事項(xiàng):1、壓力適當(dāng);

  2、無(wú)菌條件下進(jìn)行;

  3、防止?jié)B透現(xiàn)象。

  輻射滅菌:

  原理:紫外線波長(zhǎng)在200-300nm,具有殺菌作用,以265-266殺菌力強(qiáng)。此段波長(zhǎng)易被細(xì)胞中核酸吸收;可產(chǎn)生臭氧和過(guò)氧化氫。殺菌效力與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。

  缺點(diǎn):穿透力不大。距照射物<1.2m為宜。

  應(yīng)用:無(wú)菌室,醫(yī)院。

  注意事項(xiàng):對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用。

  射線滅菌:r射線,穿透力強(qiáng),適用于堆積物品的滅菌。

  化學(xué)藥品滅菌:

  原理:應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。

  殺菌劑如重金屬離子;

  抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。

  注意:與藥品的濃度高低,時(shí)間長(zhǎng)短,微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān)。

  常用化學(xué)殺菌劑有:乙醇、醋酸、石碳酸

  福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等

  3、微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)

  分離與純化:從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過(guò)程。

  為什么要進(jìn)行純培養(yǎng):平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。

  常用的分離、純化方法:

  單細(xì)胞挑取法 稀釋涂布平板法

  稀釋混合平板法 平板劃線法

  稀釋涂布平板法 :

  步驟:

  1、倒平板: 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,高氏I號(hào)培養(yǎng)基,查氏培養(yǎng)基冷卻至55-60℃時(shí),混勻后倒平板,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒4皿,高氏I號(hào)培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基各倒3皿。

  2、制備污水稀釋液:10g土樣,加入90ml無(wú)菌水中,在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無(wú)菌水的試管中,以此類推,制成不同稀釋度。

  3、涂布:將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度,然后用無(wú)菌吸管從最后三種稀釋度,即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對(duì)號(hào)放入平板上,用玻棒涂布。

  4、培養(yǎng):高氏I號(hào)和查氏倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days,牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)1-2days。

  5、挑菌落:轉(zhuǎn)至斜面,檢查是否一致,保存。

  平板劃線法:

  1、倒平板,標(biāo)記培養(yǎng)基名稱,編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。

  2、劃線方法

  稀釋混合平板法 :

  1、先加菌

  2、倒平板時(shí)注意培養(yǎng)基溫度

  3、混合均勻

  4、微生物培養(yǎng)技術(shù)

  1、斜面接種

  2、液體培養(yǎng)基接種

  3、穿刺接種

  4、將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng) 基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

  5、將生長(zhǎng)好的菌種用牛皮紙包好,置4℃冰箱中保存。

  幾種常用的保藏方法:

  1、傳代培養(yǎng)法

  保藏的菌種通過(guò)斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基(用于厭氧細(xì)菌)培養(yǎng)好后,置4C?冰箱中存放,定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放。

  可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無(wú)菌液體石蠟來(lái)進(jìn)一步延長(zhǎng)保存期。

  2、載體法

  使生長(zhǎng)合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。

  常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。

  3、懸液法

  將細(xì)菌、酵母菌細(xì)胞懸浮在一定的溶液中保存。

  溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。

  4、冷凍法

  使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。

  此法關(guān)鍵是要克服細(xì)胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護(hù)劑的使用。

  5、真空干燥法

  這類方法包括冷凍真空干燥法和L-干燥法。

  冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍,然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥。

  L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品,只是使樣品維持在10-20C?范圍內(nèi)進(jìn)行真空干燥。

  操作方法

  1、斜面保藏法

  將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上,待其充分生長(zhǎng)后,用牛皮紙將棉塞部分包扎好(棉塞換成膠塞效果更好),置4C?冰箱中包藏。

  保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2-4個(gè)月移種一次,酵母菌間隔兩個(gè)月,普通細(xì)菌一個(gè)月,假單胞菌兩周傳代一次。

  此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、使用方便,缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。

  2、液體石蠟保藏法

  將無(wú)菌石蠟加在已長(zhǎng)好菌的斜面上,其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn),使菌種與空氣隔絕。

  將試管直立,置低溫或室溫下保存。

  此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上,酵母菌可保藏1-2年,普通細(xì)菌也可保藏1年左右。

  3、穿刺保藏法

  按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種,菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán),置4℃冰箱存放。

  4、砂土管保藏法

  (1)河砂處理

  取河砂若干加入鹽酸10% ,加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液,用自來(lái)水沖洗至中性,最后一次用蒸鎦水沖洗,烘干后用40目篩子過(guò)篩,棄去粗顆粒,備用。

  (2)土壤處理

  取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土,加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次,直至中性。烘干后碾碎,用100目篩子過(guò)篩,粗顆粒部分丟掉。

  (3)砂土混合

  處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3:1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例,甚至可全部作砂或土)均勻后,裝入10x100mm的小試管或安瓿管中,每管分裝1g左右,塞上棉塞,進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次),最后烘干。

  (4)無(wú)菌檢查

  每10支砂土管隨機(jī)抽1支,將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)40h,若發(fā)現(xiàn)有微生物生長(zhǎng),所有砂土管則需重新滅菌,再作無(wú)菌試驗(yàn),直至證明無(wú)菌后方可使用。

  (5)菌懸液的制備

  取生長(zhǎng)健壯的新鮮斜面菌種,加入2-3ml無(wú)菌水(每18x180mm 的試管斜面菌種),用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下,制成菌懸液。

  (6)分裝樣品

  每支砂土管(注明標(biāo)記后)加入0.5ml菌懸液(剛剛使砂土潤(rùn)濕為宜), 用接種針拌勻。

  (7)干燥

  將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi),干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。

  (8)保存

  置4℃冰箱或室溫干燥處,每隔一定的時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。此法多用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛、效果較好,可保存幾年時(shí)間,但對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。

  5、冷凍真空干燥法

  (1)凍干管的準(zhǔn)備:中性硬制玻璃,烘干,滅菌。

  (2)菌種培養(yǎng):細(xì)菌芽孢脫落;放,霉孢子豐滿。

  (3)保護(hù)劑的配制:配制,滅菌,檢查。

  (4)菌懸液的制備:2-3ml保護(hù)劑。

  (5)分裝樣品:菌懸液每管0.2ml。

  (6)預(yù)凍:程序控溫儀降溫。

  (7)冷凍真空干燥:-50℃下抽真空。

  (8)取出樣品:輕敲松散即達(dá)標(biāo)。

  (9)第二次干燥。

  (10)熔封。

  (11)存活性檢測(cè):抽取一管進(jìn)行存活性檢查。

  (12)保存:4℃保存。

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