一、 實驗材料：

　　6-8周齡大小鼠;剪刀，鑷子，灌流用針頭，連接管，玻璃平皿，細(xì)胞篩，冰盒

　　二、實驗方法：

　　1. 培養(yǎng)用液

　　洗滌培養(yǎng)基：DMEM

　　基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12

　　2. 消化用液

　　前灌流液T1 ;后灌流液T2

　　3. 培養(yǎng)基本操作方法

　　a. 將小/大鼠進(jìn)行麻醉，待其進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后迅速將其固定于解剖板上，于超凈臺中解剖，暴露肝臟;

　　b. 沿肝門靜脈插管固定，灌流前灌流液T1(37℃下預(yù)熱)，流速5ml/min，待肝臟膨脹后迅速剪斷下腔靜脈, 灌流15min;

　　c. 前灌流液灌流完后，立即灌流后灌流液T2(37℃下預(yù)熱)，流速3ml/min，5-10min;

　　d. 取下肝臟，置于平皿中，冰上剪碎肝組織，200目濾網(wǎng)過濾;用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗網(wǎng)上組織;

　　e. 收集濾液，600rpm 離心2min;重復(fù)一次;

　　f. 棄上清，往沉淀中加2ml完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，臺盼藍(lán)染色計數(shù)，將細(xì)胞接種至鼠尾膠原包被的25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。