摘　要　流式細(xì)胞分析(flow cytometry FCM) ,即流式細(xì)胞術(shù),是用流式細(xì)胞儀(flow cytome-ter FCM) 測(cè)量液相中懸浮細(xì)胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術(shù)。它是眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科技領(lǐng)域相結(jié)合的結(jié)晶。它是物理學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等綜合運(yùn)用的產(chǎn)物。本文就流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展歷史、流式細(xì)胞儀的原理及在各領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行綜述,闡明現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)由于結(jié)合單克隆抗體技術(shù)、定量熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù),使其在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、材料學(xué)等眾多研究領(lǐng)域中的應(yīng)用有更加突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞　流式細(xì)胞術(shù)(FCM) 　歷史　原理　應(yīng)用

流式細(xì)胞分析(flow cytometry FCM) 即流式細(xì)胞術(shù),是用流式細(xì)胞儀(flow cytometer FCM) 測(cè)量液相中懸浮細(xì)胞或微粒的一種現(xiàn)代分析技術(shù)。它凝結(jié)眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科研領(lǐng)域科學(xué)家的心血。從流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)明、發(fā)展直到今天在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的拓展,每一步都是諸如電子技術(shù)、流體力學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、激光技術(shù)、生物學(xué)、生物技術(shù)、高等數(shù)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)和生物物理學(xué)等學(xué)科知識(shí)綜合運(yùn)用的結(jié)晶。現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)更是由于它結(jié)合單克隆抗體技術(shù)、定量細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和定量熒光細(xì)胞化學(xué),使其在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、材料學(xué)等眾多研究領(lǐng)域中的應(yīng)用有更加突飛猛進(jìn)的發(fā)展。流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展史也就是各個(gè)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展史的縮影。

1 　流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展歷史

1930 年,Casperrsson 和Thorell 開始致力于細(xì)胞的計(jì)數(shù);1934 年,Moldaven 是世界上最早設(shè)想使細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化的人,他試圖用光電儀記錄流過(guò)1 根毛細(xì)管的細(xì)胞數(shù)量;1936 年,Caspersson 等引入顯微光度術(shù);1940 年,Coons 提出用結(jié)合熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白;1947 年,Guclcer 運(yùn)用層流和湍流原理研制煙霧微粒計(jì)數(shù)器;1949 年,Coulter 提出在懸液中計(jì)數(shù)粒子的方法并獲得專利;1950 年,Caspersson 用顯微分光光度計(jì)在紫外(UV) 和可見光光譜區(qū)檢測(cè)細(xì)胞;1953 年,Croslannd2Taylor 應(yīng)用分層鞘流原理,成功地設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器;1953年,Parker 和Hutcheon 描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置,成為流式細(xì)胞儀的雛形; 1954 年, Beirne 和Hutchcon 發(fā)明光電粒子計(jì)數(shù)器;1959 年,B 型Coulter計(jì)數(shù)器問(wèn)世; 1965 年, Kamemtsky 等提出兩個(gè)設(shè)想:(1) 用分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分; (2) 結(jié)合測(cè)量值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類; 1967 年, Kamemtsky 和Melamed 在.Moldaven 的方法基礎(chǔ)上提出細(xì)胞分選的方法;1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事們?cè)贚osALmos ,NM(即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs) 發(fā)明第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì);1972 年,Herzenberg 研制出一個(gè)細(xì)胞分選器的改進(jìn)型,能夠檢測(cè)出經(jīng)熒光標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞的較弱的熒光信號(hào); 1975 年,Kochler 和Milstein 提出單克隆抗體技術(shù),為細(xì)胞研究中大量的特異性免疫試劑的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)今隨著光電技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,流式細(xì)胞儀已開始向模塊化發(fā)展,即它的光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)器單元和電子系統(tǒng)都可以按照實(shí)驗(yàn)要求隨意更換。進(jìn)入21 世紀(jì),流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)日臻完善,成為分析細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域中無(wú)可替代的重要工具。

2 　流式細(xì)胞儀的工作原理

流式細(xì)胞儀主要由4 部分組成:液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分析系統(tǒng)。它只能檢測(cè)懸浮的單細(xì)胞或微粒的信號(hào)。一般是將待測(cè)細(xì)胞或微粒進(jìn)行熒光染色后制成懸液標(biāo)本,在一定氣體壓力下將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室,用不含細(xì)胞或微粒的緩沖液(又稱鞘液) 在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測(cè)細(xì)胞或微粒流成一定角度,使鞘液包繞著細(xì)胞或微粒高速流動(dòng),形成一個(gè)圓形的流束(即鞘流) ,待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包裹下單行排列,依次通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)區(qū)域,經(jīng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號(hào)。流式細(xì)胞儀通常以激光作為激發(fā)光源,經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管( PMT) 接收。光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè),稱為前向散射(forward～atter ,FSC) ,這種信號(hào)基本上反映細(xì)胞體積的大小;90°散射光又稱側(cè)向散射(side scatter ,SSC) ,是指與激光束2液流平面垂直的散射光,其信號(hào)強(qiáng)度可反映細(xì)胞部分結(jié)構(gòu)的信息。熒光信號(hào)的接收方向與激光束垂直,經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其細(xì)胞內(nèi)、核內(nèi)物質(zhì)的濃度,經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào),再通過(guò)模/ 數(shù)轉(zhuǎn)換器,將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)。計(jì)算機(jī)采集所測(cè)量到的各種信號(hào)進(jìn)行計(jì)算處理,將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上,也可以打印出來(lái),還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲(chǔ)在硬盤上,以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)的顯示視測(cè)量參數(shù)的不同而有多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá),其x 軸為測(cè)量的散射光或熒光的強(qiáng)度(可以是線性軸,也可以選擇對(duì)數(shù)軸) ,縱軸為相對(duì)細(xì)胞數(shù)。一般來(lái)說(shuō),流式細(xì)胞儀坐標(biāo)軸的分辨率有256 或1024 通道數(shù),這視其模/ 數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對(duì)于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù),既可以單獨(dú)顯示每個(gè)參數(shù)的直方圖,也可以選擇二維的散點(diǎn)圖、等高線圖或三維的立體視圖等。

流式細(xì)胞儀還可以對(duì)分析中的目的細(xì)胞進(jìn)行分選提取,它通過(guò)分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。在流動(dòng)室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體,可以產(chǎn)生高頻振蕩,使液流斷裂為均勻的液滴,待測(cè)細(xì)胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負(fù)電荷,當(dāng)帶電液滴通過(guò)電場(chǎng),在電場(chǎng)的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn),然后落入相應(yīng)的收集器之中,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選。流式細(xì)胞儀的分選速度從以往的5000 個(gè)/ s 提高到現(xiàn)在的25000 個(gè)/ s。

流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展趨勢(shì)可歸納為: ①流式細(xì)胞儀從單純大型儀器發(fā)展為適應(yīng)各種實(shí)際應(yīng)用的便攜式、臺(tái)式、高分辨率、高質(zhì)量分選的研究型流式細(xì)胞儀; ②對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光參數(shù),從采用熒光單色、雙色分析發(fā)展為多色分析,目前最多可同時(shí)檢測(cè)15 種熒光信號(hào); ③從檢測(cè)參數(shù)的相對(duì)定量發(fā)展為絕對(duì)定量; ④從檢測(cè)參數(shù)的手動(dòng)人工分析發(fā)展為利用計(jì)算機(jī)軟件的自動(dòng)分析; ⑤所采用的熒光試劑,從非配套試劑發(fā)展為配套的試劑盒試劑。而這一切,就要求流式細(xì)胞儀使用者和科研人員,一定要不斷地有意識(shí)地學(xué)習(xí)上述各門學(xué)科知識(shí),只有這樣才能更好地將流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)的臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)科學(xué)研究工作中去。